المبدأ الأساسي من الوقت الحقيقي الكمية فكر

1. في الوقت الحقيقي الكلور الكمي

في! ، تم تقديم تفاعل البلمرة الكمية في الوقت الفعلي (qPCR في الوقت الفعلي) لأول مرة بواسطة النظم البيولوجية المطبقة في الولايات المتحدة. يشير ما يسمى qPCR في الوقت الفعلي إلى إضافة مجموعات الفلورسنت إلى تفاعل الكلور لمراقبة إشارة الفلورسنت باستمرار. يمكن استخدام ترتيب المظهر وتغيير قوة الإشارة لتحليل الكمية الأولية للجين المستهدف في الوقت الفعلي. اختراع هذه التكنولوجيا يحقق قفزة من النوعية إلى الكمية الكلور.

2. المواد الكيميائية المستخدمة في الفلورسنت الكلور

في الوقت الحالي ، ينقسم qPCR في الوقت الفعلي إلى فئتين: أصباغ الفلورسنت ومجسات الفلورسنت وفقًا للمواد الكيميائية الفلورية المختلفة المستخدمة.

3. الأصباغ المستخدمة في الفلورسنت الكلور

وتسمى الأصباغ الفلورية أيضًا أصباغ ربط الحمض النووي. جزيء الصبغة الرئيسي المستخدم حاليًا هو SYBR Green I. SYBR Green يمكنني الربط تحديدًا بالأخدود البسيط لـ DNA ثنائي الشق. SYBR Green مجاني لا يوجد لدي أي إشارة فلورسنت تقريبًا ، ولكن يرتبط بحمض الحمض النووي المزدوج. بعد ذلك ، يمكن زيادة إشارة الفلورسنت مئات المرات. مع زيادة منتج الكلور الكلور ، تزداد أيضًا كمية الربط لمنتج الكلور والصبغة ، وتمثل كثافة الإشارة الفلورية عدد جزيئات الحمض النووي مزدوجة الجديلة.

تتمثل مزايا الأصباغ الفلورية في أنها سهلة الاستخدام ، ويمكن دمجها مع أي منتج من منتجات الكلور الكلور ، وغير مكلفة.

بشكل عام ، تعد طريقة SYBR Green I واحدة من أكثر تجارب qPCR في الوقت الفعلي أساسية وشائعة الاستخدام.

4. تحقيقات لوميض الكلور

أكثر مسابير الفلورسنت استخدامًا في الوقت الفعلي هي مسابير تقمان. المبدأ الأساسي هو تصميم وتوليف مسبار يمكنه تهجين الجين المستهدف على وجه التحديد. نهاية المسبار 5 إنش تحمل علامة فلوروفور ، والنهاية 3 إنش تحمل علامة مجموعة من الاستعلامات.

في الظروف العادية ، تكون المسافة المكانية بين المجموعتين قريبة جدًا ، ولا يمكن للجين الفلوري أن يتلألأ بسبب التبريد. أثناء تضخيم البكر ، يرتبط التمهيدي والمسبار بالنموذج في نفس الوقت ، ويقع موضع الربط للمسبار بين بادئات المنبع والمصب.

عندما يمتد التضخيم إلى الموضع الذي يرتبط فيه المسبار ، يستخدم إنزيم Taq نشاط exonuclease 5 بوصة لشق جزيء الفلورسنت المرتبط بالطرف الخامس من المسبار ، مما تسبب في الفلورس. يتناسب عدد جزيئات الفلورسنت المكتشفة مع عدد منتجات الكلور الكلور ، وبالتالي ، يمكن حساب عدد قوالب الحمض النووي الأولية وفقًا لكثافة الفلورسنت في نظام تفاعل الكلور.

تعمل تقنية مسبار TaqMan على حل مشكلة الجمع بين الأصباغ الفلورية والتضخيم غير المحدد. بعد التفاعل ، ليست هناك حاجة للكشف عن منحنى الذوبان ، مما يقلل من وقت الاختبار.

تتمثل مزايا تقنية مسبار التقمان في الخلفية الفلورية المنخفضة ، والحساسية العالية ، واستقرار التهجين العالي ، ودقة الطيف الفلورية الجيدة ، وخصوصية عالية.

نظرًا للخصوصية العالية لتحقيقات التقمان ، يمكن استخدامها للتمييز بين الأليلي ، خاصة بالنسبة لأشكال تعدد المورثات البشرية ولتمييز وقياس السلالات القائمة على SNP.